生物素-亲和素标记技术

时间:2012-06-27

20世纪60年代初发现了生物素(biontin,B)和卵白素(avidin,A),其亲和力至少比抗原-抗体结合力高百万倍,是目前发现的自然 界中具有最强亲和力的物质。生物素广泛分布于动、植物组织中,以卵黄和肝组织含量较高,分子质量244.31 ku。亲和素亦称抗生物素或卵白素,是从卵白蛋白中提取的一种由4个相同亚基组成的碱性糖蛋白,还可由阿维丁链霉菌(Streptomyces avidinii)ATCC 27 419在生长过程中分泌产生链霉亲和素(streptavidin,SA)[1],分子质量为68 ku,等电点(pI)为10.5,耐热,并耐受多种蛋白水解酶的作用[2]。

1 生物素-亲和素系统的特点

BAS具有高 灵敏度、高特异性、高稳定性和适用性等特点。生物素易与蛋白质和核酸类等生物大分子结合,再和生物素衍生物结合,将信号多级放大,能保持大分子物质的原有 生物活性。亲和素与生物素间的结合具有极高的亲和力,其反应呈高度专一性,不增加非特异性干扰,也不会因反应试剂浓度高低受影响。酸、碱、变性剂及有机溶 剂均不会影响亲和素与生物素的结合力。裴仁军等[3]试验结果表明,链霉亲和素与生物素能够在结合表面形成均一的多层膜维系紧密的结合。BAS不仅能与 酶、荧光素和放射性核素等各类标记技术结合,还可制成亲和介质,用于分离提纯。BAS操作方便,反应结果可用肉眼观察,实验成本低[4]。

2 生物素-亲和素标记技术的主要方法

2.1 桥-亲和素-生物素标记法

桥 -亲和素-生物素标记法(bridged avidin-biotin technique,BAB)分为直接法和间接法,直接法是以游离的亲和素(或链霉亲和素)作为桥联剂,利用亲和素的多价性,将生物素化抗体复合物与标记 生物素(如酶标生物素)联结起来,达到检测反应分子的目的。间接法则是在抗原与特异性抗体结合反应后,再用生物素化的第二抗体与抗原抗体复合物结合,从而 使灵敏度进一步提高。由于生物素化抗体分子上连有多个生物素,因此,最终形成的抗原-生物素化抗体-亲和素-酶标生物素复合物可积聚大量的酶分子。加入相 应酶作用底物后,会产生强烈的酶促反应,提高检测灵敏度。Smith K A[5]利用间接BAB法检测乙型肝炎表面抗原(HBsAg),其灵敏度比常规ELISA高1 000多倍。

2.2 亲和素-生物素-过氧化物酶法

即 亲和素-生物素-过氧化物酶法(avidin-biotin complex technology,ABC),预先按一定比例将亲和素(或链霉亲和素)与酶标生物素结合,形成可溶性的亲和素(或链霉亲和素)-生物素-过氧化物酶复 合物,当其与检测反应体系中的生物素化一抗或生物素化二抗相遇时,复合物中未饱和的亲和素(或链霉亲和素)结合部位即可与抗体上的生物素结合。在亲和素- 生物素-过氧化物酶复合物形成时,一个标记了生物素的酶分子可通过其生物素连接多个亲和素(或链霉亲和素)分子,一个亲和素(或链霉亲和素)分子又可桥联 多个酶标生物素分子,这样就形成具多级放大作用的晶格样网状结构,其中网络了大量酶分子[6]。ABC法背景染色淡,方法简单,节约时间,可用于双重或多 重免疫染色,尤其在组织切片和细胞悬液中抗原的检测和亚细胞水平定位分析中应用较广[7]。

2.3 标记生物素-抗生物素法

标 记亲和素-生物素法(labeled avidin-biotin,LAB)直接法是以标记亲和素(或链霉亲和素)直接与免疫复合物中的生物素化一抗连接进行酶呈色反应,间接法是采用生物素化 的二抗和抗原结合,由于加入了二抗,较直接法检测灵敏度要高,对免疫细胞中免疫球蛋白的定位具有特异性。LAB法需以生物素标记一抗,应用不如ABC法普 遍,与ABC法相比,LAB法操作较简单,但灵敏度较低[8]。何晓顺等[9]采用LAB法检测切除的病理标本中胆管上皮细胞角蛋白CK9和CKl7、癌 胚抗原、肝细胞蛋白,以判断肿瘤组织学来源。

3 生物素-亲和素标记技术的应用

3.1 在免疫学中的应用

3.1.1  在免疫荧光技术中的应用 BAS应用于免疫荧光分析(fluorescence immunoassay,FIA)技术,可用荧光素直接标记亲和素(或链霉亲和素)或采用游离亲和素(或链霉亲和素)搭桥,两端分别连接生物素和荧光素。 与常规荧光抗体法或单独的BAS标记法相比,BAS标记法结合荧光抗体技术可明显地提高检测的灵敏度和特异性[10]。张锦明等[11]用99Tcm替代 111In标记BAS在肿瘤放免显像预定位DTPA-生物素溶液,结果测得99Tcm-DTPA-生物素的标记率大于90%。

3.1.2 在免疫放射技术中的应用 BAS与免疫放射分析(immunoradiometric analysis,IRMA)方法偶联,先将针对不同抗原决定簇的固相抗体和生物素化抗体与抗原(标准抗原和待测抗体)同时反应,在固相载体表面形成双抗 体夹心免疫复合物,再用放射性同位素标记的亲和素(或链霉亲和素)与复合物中的生物素结合,最终使反应信号放大。李贵平等[12]用153Sm标记 BAS,再标记抗CEA 单抗,最后在结肠癌裸鼠模型中进行γ显像和体内分布测定,结果肿瘤显像时间大大缩短。郝君等[13]采用生物素-磁珠富集微卫星,与传统放射性同位素杂交 法相结合,构建筛选大黄鱼的微卫星文库。

3.1.3 在胶体金技术中的应用 BAS应用于胶体金技术,其原理为带正电荷的链霉亲和素标记 的带负电荷的胶体金颗粒能与生物素紧密结合,使检测信号在只有胶体金标记或只有BAS标记的基础上得到扩大[14]。吕丰等[15]应用石英晶体微天平 (QCM)研究了基于BAS的葡萄糖氧化酶的固定化,结果在利用BAS固定过的葡萄糖氧化酶过程中,经过纳米金颗粒修饰的QCM基片对酶的吸附量比未经修 饰的基片多。张志锋等[16]以组装型金磁微粒和氨基末端磁性微粒为载体分别通过物理吸附和共价作用制备两种链亲和素-磁性微粒,其具有较高的游离生物素 结合容量以及较高的生物素标记寡核苷酸的结合能力。

3.1.4 在免疫酶技术中的应用 BAS应用于免疫酶技术,通过生物素-亲和素将免疫复合物与辣根过氧化物酶连接起来,形成免疫酶-生物素-亲和素法。赵金富等 [17]用合成的雌三醇-生物素复合物(E3-Biotin)结合辣根过氧化物酶标记的亲合素(HRP-Avidin)作为免疫分析探针测定血清中的雌三 醇。结果表明,具有很高的灵敏度、稳定性、重现性和抗非特异性吸附干扰的能力。魏孔吉等[18]建立了可用于快速、灵敏地检测双酚A的生物素-亲和素放大 酶联免疫吸附测定法,样品处理简单,结果满意。宋晓荣等[19]用酯化生物素标记N15C,辣根过氧化物酶标记N16D,检测cTnT,检测灵敏度为 1.0 μg/L,特异性高。

3.1.5 在ELISA中的应用 用生物素化的抗体替代常规ELISA中的酶标抗体,然后连接亲和素-酶 结合物(BA-ELISA)、或亲和素及酶标生物素(BAB-ELISA)或ABC试剂(ABC-ELISA),从而使反应信号放大,提高检测的灵敏度。 王传彬等[20]用生物素标记的纯化抗禽流感病毒H5亚型血凝素单抗和酶标亲和素检测H1、H15亚型AIV标准毒株和H5、H7、H9亚型AIV分离 株,与血凝和血凝抑制试验比较,纯化后的单抗具有良好的反应活性。祝军等[21]将BA-辣根过氧化物酶复合物系统ELISA策略,对ANEPⅢ寡核苷酸 适配子的亲合力进行测定。

3.2 在分子生物学中的应用

BAS在分子生物学领域中的应用日渐增多,目前主要集中在以生物 素标记核酸探针进行的定位检测以及将免疫测定技术与PCR结合建立免疫-PCR(immuno-PCR)用于抗原的检测等方面。自从合成了生物素化的脱氧 三磷酸脲苷(dUTP)和UTP等核苷酸单抗以来,以生物素化多核苷酸为探针的核酸杂交技术有了很大发展,常用于Southern、Northern和原 位杂交等。试验时,标记探针先与细胞或染色体原位(或是固定在乙酸纤维素膜上)的变形核酸分子进行杂交,然后用偶联了酶或荧光物质的亲和素(或链霉亲和 素)识别杂交互补片段,使其显色或产生荧光,这种技术克服了放射性核酸探针标记与检测的缺点,应用潜力很大[22]。

3.3 在组织化学中的应用

将 混有亲和素和生物素的染料浓聚于靶细胞表面,能使细胞与染料更好的结合,最大优点为精确度被提高,结果简单易测,更利于靶细胞结构的观察。张志强等 [23]应用ABC法对赤链蛇消化道5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)细胞的分布密度和形态学特点进行观察,结果显示5- HT在其整个消化道中均有分布。徐卫等[24]用SAP法对儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)和成人患者的ALL骨髓和外周血进行Ki-67抗原和 Bcl-2蛋白的检测,结果发现Ki-67抗原在儿童ALL中的表达略低于成人。

4 结语

综上所述,BAS具有诸多优 点,主要应用于抗原、抗体、细胞等的定位和检测,能将形态、定位研究与功能、代谢研究有机地结合在一起,此方法经不断改进日趋成熟,其相关试剂盒也逐步商 品化,在各个学科的应用已占有相当高的比例,科研工作中的各种标记技术都是为了使信号不断地放大,BAS与其他标记技术联合应用更能成倍的扩大目标信号, 使检测结果更加精确,更有说服力,因此,BAS在其他领域的渗透成为现阶段研究的重要课题,尚有更广阔的发展空间和应用前景。


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